シロイヌナズナ（およびその他）のスポーツベット ボーナス（方法 1）

この手順は一般化されたものです. より小さいスポーツベット ボーナスの使用も可能. この手順は他の植物組織にも適用できます, 根を含む, 茎, 花, そして長角果. メアリー・ロスまでご連絡ください。 mrroth@ksu.edu (件名を含めてください)お問い合わせ.

A .このメソッドの PDF, 配送スポーツベット ボーナスを含む, 見つかります ここ.

1. 葉を 1 ～ 8 枚（または小さな植物全体を 3 枚まで - 注 #2 を参照）; 0 を加えた 75 °C (予熱) スポーツベット ボーナス 3 ml に素早く浸します。.01% BHT (ブチル化ヒドロキシトルエン, e.g., Sigma B1378) を加熱し続けます 15 分. テフロン加工のスクリューキャップが付いた 50 ml (25 x 150 mm) ガラス管を使用します. 注意 #1: サンプリング後すぐに植物をスポーツベット ボーナスし、イソプロパノールを予熱することが非常に重要です. 植物は非常に活性の高いホスホリパーゼ D を持っています, 負傷時に発動する; 採取した組織を熱いイソプロパノールに素早く入れないと、ホスファチジン酸が生成されます. 注 #2: 分析を行うには, シロイヌナズナの葉の一部だけが必要. より多くの組織を使用すると、サンプル間のばらつきが減少します; 少量の組織を使用すると、個々の植物および植物組織に関する情報が得られる. 乾燥重量 5 ～ 30 mg, ステップ 6 と同様に測定, 推奨.

2. 1 を追加.5 ml クロロホルムおよび 0.水 6 ml, 渦; その後、室温で（インキュベーターを振盪して） 1 時間. 転送 (長い), ガラス製パスツールピペット) 脂質スポーツベット ボーナス物をテフロン加工されたスクリューキャップ付きのガラス管に移す.

3. クロロホルム/メタノール (2:1) 4 ml と 0 を加えます.01% BHT; 30 分間振る. すべてのサンプルの葉が白くなるまで、すべてのサンプルに対してこのスポーツベット ボーナス手順を繰り返します, ただし、必ず各サンプルを同じ回数スポーツベット ボーナスしてください. (すべてのスポーツベット ボーナスでは、各サンプルに 1 つのピペットを使用します, 残りの材料をスポーツベット ボーナスする間、除去されたスポーツベット ボーナス液にそれらを残す.) その後のスポーツベット ボーナスでは、30 分よりやや長くチューブを振とうさせても問題ありません, スポーツベット ボーナスが難しい組織の場合は、スポーツベット ボーナスの 1 つを一晩振盪しておくのが良い方法です. 通常、約 5 回のスポーツベット ボーナスが必要になります, イソプロパノールを含むものを含む.

4. オプションの逆洗浄: 合わせたスポーツベット ボーナス物に 1 ml 1 M KCl を加えます, 渦または振動, 遠心分離機, 上のフェーズを破棄する. 水を 2 ml 加えます, 渦または振動, 遠心分離機, 上のフェーズを破棄する. これらの逆洗により、よりきれいな脂質サンプルが得られます, ただし極性の高い脂質は少量, リゾ脂質など, 失われるでしょう.

5. 脂質スポーツベット ボーナス物の入ったチューブを窒素で満たす, -20°C で保存 (冷凍庫). 発送の準備ができたら, 窒素ガス下またはスピードバックで溶媒を完全に蒸発させます, 約 1 に再溶解します.0 ml クロロホルム. 転送先 2.0 ml 透明ガラスバイアル、テフロン加工スクリューキャップ付き (例: 透明なガラス; 2mL; PTFE 裏地付きキャップ; 1/2 博士., フィッシャーサイエンティフィックカタログ #03-391-7A, サーモサイエンティフィック番号.: B7800-1). スポーツベット ボーナス. いつも スポーツベット ボーナスを送る前にお知らせください: mrroth@ksu.edu

6. スポーツベット ボーナスした葉を105°Cのオーブンで一晩乾燥させます; 「乾燥」重量の重量を量り、できれば小数点以下 6 桁まで (グラム単位で) 計量できる天秤を使用してください (i.e., マイクログラム).

スポーツベット ボーナス 1 のビデオ デモンストレーション:

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スポーツベット ボーナス (方法 2), シロイヌナズナとソルガムで試験済み)

脂質スポーツベット ボーナスのより迅速な方法が最近 Shiva らによって報告されました. (2018): https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-018-0282-y

このアプローチでは、1 ステップで葉から適切にスポーツベット ボーナスされます. 方法 2 に従う場合, 脂質スポーツベット ボーナス物から植物材料を分離した後, 上記のプロトコルのステップ #5 と #6 に従います.

スポーツベット ボーナス 2 のビデオ デモンストレーション:

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葉の脂質スポーツベット ボーナス方法 (方法 3 - GIPC 分析が必要な場合), 他の脂質に加えて)

スポーツベット ボーナス物にグリコシルイノシトールホスホセラミド (GIPC) を含めたい場合, 「溶媒 H」で葉をさらにスポーツベット ボーナスする必要があります.

Markham らのスポーツベット ボーナス. (2006, http://www.jbc.org/content/281/32/22684.full.html):
イソプロパノール/ヘキスポーツベット ボーナス/水 55:20:25, 上相は破棄されました
2-プロパノール 440 ml、0.01% BHT (0.04g)
160 ml ヘキスポーツベット ボーナス (HPLC グレード)
水 200 ml

これらを混ぜ合わせます(激しくかき混ぜます), そして廃棄のために上のフェーズを削除します. 下相は透明であるはずで、スポーツベット ボーナス です.

1. スポーツベット ボーナス 1 のステップ 1 ～ 3 またはスポーツベット ボーナス 2 のワンステップスポーツベット ボーナスを完了する.

2. 残りの葉組織へ, 「ソルベント H」を 4 ml 追加. チューブを加熱ブロック上に置き、60°C で 15 分間. 溶媒を除去し、前にスポーツベット ボーナスしたクロロホルム/メタノール脂質と混合します.

3. さらに 3 回繰り返し、合計 4 回の「溶媒 H」スポーツベット ボーナス. スポーツベット ボーナスされたすべての脂質と溶媒の総量は約 37 ml (方法 1 を使用した場合).

4. チューブを窒素で満たす, -20°C で保存 (冷凍庫). 発送の準備ができたら, 窒素ガスまたはスピードバック下で完全に蒸発, 40℃未満, 約 1 に再溶解します.0 ml クロロホルム. 転送先 2.0 ml 透明ガラスバイアル、テフロン加工スクリューキャップ付き (例: 透明なガラス; 2ml; PTFE 裏地付きキャップ; 1/2 博士., フィッシャーサイエンティフィックカタログ #03-391-7A, サーモサイエンティフィック番号.: B7800-1). スポーツベット ボーナス. いつも スポーツベット ボーナスを送る前にお知らせください: mrroth@ksu.edu

5. 溶媒 H でスポーツベット ボーナスされた葉 くっつきます 乾いたらグラスに注ぐ, 少量のクロロホルムを加えて葉をボール状に押し込まない限り. ボールを形成するにはヘラが効果的. スポーツベット ボーナスした葉をオーブンで 105°C で一晩乾燥させます, 小数点以下 6 桁までの重さ (0.000000g) 乾燥スポーツベット ボーナス組織重量. (乾燥したティッシュを秤量ボートに放り込むだけ.)