in situ ハイブリダイゼーション (ISH) のためのプラスミド (プローブ) スポーツベットアイオー 出金 の単離
- 単一コロニーから Kaput スポーツベットアイオー 出金内の 2 mL 培養物を接種し、37°C のシェーカー上に一晩置きます.
- 2 mL の前培養物をフラスコに注ぎ、400 mL の培養物を 1 L フラスコに接種します; 振盪しながら スポーツベットアイオー 出金 で 4 ～ 5 時間インキュベートします.
- 6 で 10 分間遠心分離して細胞を回収します,000 rpm、4°C. 上清をデスポーツベットアイオー 出金トし、氷上に斜めに置き、残りの液体をペレットから排出する. 数分後に滅菌ピペットで残りの液体を除去します.
- ペレットを 5 mL の溶液 I (50 mM グルコース) に再懸濁します。, 25 mM トリス pH 8.0, 10 mM EDTA); 培養物を 50 mL Nalgene ポリアロマースポーツベットアイオー 出金管に移します.
- 溶液 II を 10 mL 追加します (O.2N NaOH, 1% SDS), スポーツベットアイオー 出金, そしてゆっくりと繰り返し反転させて混ぜます; 溶液を氷上で 10 分間放置します.
- 7 を追加.5 mL の溶液 III (3 M NaAc pH 4).8), スポーツベットアイオー 出金, 静かに反転させて混ぜます.
- 12 の遠心分離管,000 rpm、4°C で 15 分間, 上清を 2 番目の 50 mL チューブに注ぎます, イソプロパノール 11 mL を追加, パラフィルムで覆い、チューブを静かに反転して混合し、5 分間遠心分離します,000 rpm、4°C, 上清をデスポーツベットアイオー 出金トする, ペレットを 70% エタノールですすぐ; チューブから 10 分間水を抜きます, ほぼ乾燥するまで凍結乾燥する; 4のペレットを嫌う.5 mL TE.
- 4 を追加.7 g の CcCl と 0.TE 中の 10 mg/ml 臭化エチジウム溶液 4 mL (サンプルの密度は 1 の間です).55 と 1.59 g/mL, TE または CsCl を追加して調整; CsCl 精製を行わないプラスミド スポーツベットアイオー 出金 もビオチン標識に使用できます, ただし、CsCl 精製プラスミド スポーツベットアイオー 出金 を使用するとより良い結果が得られます).
- 溶液をベックマンの「13 x 51」ポリアロマー クイックシール スポーツベットアイオー 出金に移す, 首のすぐ下まで満たします（スポーツベットアイオー 出金の重さは 9 になるはずです）.45-9.6 g), そしてシール.
- 20°C、65 でスポーツベットアイオー 出金管,000 rpm 4 時間または 55,一晩で 000 rpm.
- 針と注射器を使ってスポーツベットアイオー 出金からプラスミドバンドを取り出します, そして 1 に転送してください.5 mL スポーツベットアイオー 出金.
- 1 倍量の飽和イソプロパノールを追加します (等量のイソプロパノールと 20 X SSC pH 7 を混合します).0) よく混ぜます. スポーツベットアイオー 出金機, または数分間放置する. ピペットで上相を除去.
- 抽出を 4 ～ 5 回繰り返します, スポーツベットアイオー 出金プロパノールのピンク色が消えるまで.
- スポーツベットアイオー 出金 サンプルを 2 倍量の TE で希釈します, 1/10 量の 3M NaAc pH 7 を加え、よく混合します.
- 2倍量の95%エタノールを加え、スポーツベットアイオー 出金ます.
- 5分間遠心分離します, ドレンスポーツベットアイオー 出金, ペレットとスポーツベットアイオー 出金の側面を 70% エタノールですすぐ, エタノールを排出する, そしてペレットを乾燥させます.
- スポーツベットアイオー 出金 を 400 µL TE に溶解します, 20 µL RNase A (10 mg/mL) を追加, ミックス, 室温で 15 分間インキュベートします.
- 等量の 1:1 フェノール:クロロホルム溶液を加えます, よく混ぜる, 短時間遠心分離する, 上相を別のスポーツベットアイオー 出金に移します.
- 同量のクロロホルムを加える, よく混ぜる, 短時間遠心分離する, 上相を別のスポーツベットアイオー 出金に移します.
- 3 M NaAc とエタノールで DNA を沈殿させ、スポーツベットアイオー 出金 400 µL TE に溶解します.
- 分光光度計を使用するか、ミニゲルでの電気泳動によって スポーツベットアイオー 出金 濃度を測定します.
